Estabilidad genética de yuca propagadas in vitro mediante embriogénesis somática

Introducción

En Venezuela la yuca es un cultivo tradicional, que, junto con el frijol, maíz y el plátano, conforman la dieta de nuestra población rural (Guzmán, 2004) y ha sido considerado un cultivo marginal, tradicionalmente desarrollado por los agricultores de menores recursos económicos (Montaldo, 1996).

Uno de los principales problemas que enfrentan los productores de yuca de nuestro país es la carencia de “semilla” y la baja calidad del material de siembra disponible (Romay et al., 2006; Romero y Flores, 2020), debido principalmente a la susceptibilidad del cultivo al ataque por enfermedades virales y bacterianas, efecto de factores abióticos y bajas tasas de multiplicación por estacas. Los programas de mejoramiento genético tradicionales del cultivo, aunque han dado buenos resultados en la selección de cultivares, no han sido efectivos en la oferta de un material sano adaptado a las diferentes condiciones agroclimáticas productoras de yuca del país, y mucho menos a la industrialización del cultivo, como ocurre en países vecinos como Brasil donde la cadena agro-industrial de la yuca muestra que, al menos para la producción de almidón, ha crecido pasando de unas 400000 t en 2000 a 676700 t en 2023 (Centro de Estudios Avançados em Economia Aplicada [CEPEA], 2023).

La Biotecnología puede contribuir a la oferta de una “semilla” con la calidad requerida por nuestros agricultores, haciendo uso de las técnicas de cultivo de tejidos, como es en este caso la embriogénesis somática. Sin embargo, es importante destacar, que la uniformidad genética es uno de los prerrequisitos de la micropropagación de especies vegetales.

Una de las consecuencias del proceso de cultivo in vitro es la presencia de variación somaclonal en los individuos regenerados, originado por diferentes factores relacionados con el genotipo de la especie e interacción fisicoquímica del sistema de cultivo. La variación somaclonal generalmente es espontánea, y los cambios pueden ser heredables o no. Las heredables pueden incluir alteraciones genéticas como mutaciones puntuales, deleciones o reordenamientos cromosómicos, mientras que las no heredables o epigenéticas afectan la expresión génica sin modificar la secuencia del ADN, como ocurre con la metilación o la modificación de histonas (Patiño Torres, 2010). Una de las estrategias utilizadas para identificar las variantes somaclonales son los marcadores moleculares y su detección temprana puede contribuir con la calidad y seguridad de las plantas propagadas (Ramírez-Mosqueda et al., 2024). Estudios sobre la fidelidad e identidad genética de plantas propagadas in vitro utilizando marcadores basados en el ADN se han realizado en plantas como plátano (Rout et al., 2009), yuca (Osorio et al., 2012), agave (Chávez Ortiz, 2020); pasturas (Carrodeguas-González y Zúñiga-Orozco 2021).

Existen diversas técnicas moleculares para evaluar la uniformidad y variabilidad genética en cultivos in vitro. Los RFLP y RAPD fueron ampliamente utilizados en etapas iniciales, aunque presentan limitaciones de reproducibilidad. En contraste, los AFLP y SSR se han consolidado como los métodos más confiables y reproducibles, capaces de detectar variaciones somaclonales incluso en regiones repetitivas o no codificantes. Los SSR, en particular, destacan por su abundancia en el genoma, carácter codominante y alto nivel de polimorfismo, lo que permite identificar heterocigotos y homocigotos con gran precisión (Whankaew et al., 2012; Tiwari et al., 2013). Estudios recientes en agave y especies tropicales confirman esta tendencia, empleando AFLP y SSR junto con la caracterización de genes como SERK, lo que refuerza su papel central en el monitoreo de la fidelidad genética en programas de micropropagación (Paredes-Ulloa et al., 2023; Reyes-Díaz & Arzate-Fernández, 2024).

Los marcadores moleculares tipo microsatélites han permitido detectar diferencias genéticas o similitud en diferentes especies propagadas in vitro, tales como: oca (Oxalis tuberosa) (Ferro Mauricio, 2021); coco (Cocos nucifera L.) (Bandupriya et al., 2017). En yuca, Raemakers  et al., (1993) describen cómo la micropropagación de yuca permite conservar genotipos élite libres de enfermedades, pero puede generar variaciones genéticas. Por eso, se recomienda el uso de marcadores SSR (microsatélites) para verificar la fidelidad genética de las plantas propagadas in vitro y detectar posibles mutaciones somaclonales.

En yuca la propagación in vitro por embriogénesis somática es dependiente del genotipo (Yelli et al., 2023), en tal sentido, se evaluó el potencial de propagación por ES de los clones: PER-183, cubana y Criolla, obteniéndose mayores tasas de multiplicación en PER-183 (Albarrán et al., 2018), siendo así seleccionado para la evaluación de estabilidad genética por SSR. El PER-183 es un híbrido seleccionado en los valles interandinos de Colombia por su alto rendimiento agronómico, adaptación agroecológica, buena textura y sabor (Rosero Alpala et al., 2023) y también por su tolerancia a la enfermedad viral “Cuero de sapo” (Álvarez, 2015), enfermedad que ingresó en el país desde el año 2001 según reportes de Chaparro-Martínez et al. (2001).

Materiales y Métodos

Se utilizaron plantas madre de campo y propagadas in vitro por embriogénesis somática del clon PER-183. Para la caracterización molecular se utilizaron 15 marcadores moleculares tipo microsatélites según Chavarriaga et al. (1998) y Mba et al. (2001) seleccionados por su alto polimorfismo en yuca (Cuadro 1).

Cuadro 1

Secuencia de los primers SSR utilizados para la caracterización molecular en el clon PER-183.

La extracción de ADN se realizó según el protocolo propuesto por Chavarriaga et al. (1998) y Mba et al. (2001) en muestras de hojas jóvenes. Para el análisis del ADN se tomaron muestras de hojas provenientes de 13 plantas madre establecidas en condiciones de umbráculo provenientes del cultivo de estacas y 11 de plantas propagadas por embriogénesis somática. El ADN se cuantificó en un NANODROP-1000 Espectrophotometer Thermo Scientific y se diluyó a una concentración aproximada de 25 ng.µL^-1. La mezcla de reacción fue de 15 µL compuesta por: Buffer 5X, MgCl2 25 mM, Taq polimerasa 1U, DNTP 200 uM, 0.1 BSA mg.mL^-1, agua destilada estéril. Para las reacciones de PCR se utilizó un termociclador marca TECHNE TC512. Las condiciones de amplificación fueron: 1) 94°C por 1 min, 2) 94°C por 30 s, 3) 55°C por 1 min, 4) 72°C por 2 min, 5) Desde el paso 2, se repitió 29 veces, 6) 72°C por 5 min, 7) 4°C durante tiempo indeterminado. La longitud de los productos de amplificación se estimó por comparación con un marcador de peso molecular de 25 pb (PROMEGA®).

Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% mezclando en partes iguales agarosa con agarosa para pequeños fragmentos MetaPhor™. Los productos de amplificación se visualizaron con el equipo ChemiDoc-It™, software Quantity One®. Los patrones de bandas obtenidos fueron codificados como cero y uno para fragmentos ausentes y presentes, respectivamente. Luego, se construiyó una matriz binaria que permitió realizar el análisis estadístico mediante el uso del software INFOSTAT v.1/profesional. Se determinó el contenido de información polimórfica para evaluar la capacidad discriminatoria de cada marcador del SSR en detectar locus polimórficos.

Para el análisis se empleó el método de agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), utilizando la matriz de similitud para generar el dendrograma de genotipos. El coeficiente de Jaccard se calculó mediante la fórmula (Rohlf y Sokal, 1981).

Resultados y Discusión

El análisis molecular permitió obtener un total de 151 bandas, de los cuales Y181, Y64 y Y100 no mostraron polimorfismos entre la planta madre y las propagadas por embriogénesis somática (Figura 1). Las bandas polimórficas las produjeron los loci Y63, Y69 y Y171 (figura 2).

Figura 1

Perfiles electroforéticos en geles de agarosa empleando los iniciadores SSR Y181 (A) y Y64 (B) en vitroplantas de yuca regeneradas por embriogénesis somática y la planta madre.

Nota. Se observa la uniformidad de las bandas entre la planta madre (1) y las propagadas in vitro (2-13) con los dos iniciadores utilizados. M: Marcador de peso molecular.

Figura 2

Perfiles electroforéticos en geles de agarosa empleando los iniciadores SSR Y63 (A) y Y171 (B) en vitroplantas de yuca regeneradas por embriogénesis somática y la planta madre.

Nota. Se observa el polimorfismo existente entre las plantas 9 a la 13, lo mismo ocurre con Y171 entre las plantas 5 a la 13. M: Marcador de peso molecular.

El análisis de conglomerados a través del método UPGMA, indica que la estructura de agrupamiento observado en el dendrograma (figura 3) representa aproximadamente el 79,9% de la información de la matriz de distancias genéticas original, sugiriendo una buena representación de las relaciones y correspondencia entre el modelo propuesto y los datos analizados. El coeficiente de correlación cofenética (CCC) es una medida de fidelidad del agrupamiento, por lo que el valor obtenido indica que el dendrograma (árbol genético) representa de forma adecuada y confiable las distancias genéticas originales calculadas entre las muestras.

El análisis de agrupamiento arrojó 3 grupos (figura 3), el primero conformado por las plantas 1, 2, 3, 4, 5 y 10, el segundo grupo por 6, 7, 8 y 9. Un tercer grupo formado por los individuos 11 y 12. Se escogió 0,27 como el nivel de similitud o distancia para definir los grupos o cluster.

La variabilidad observada durante la embriogénesis somática de yuca puede atribuirse a cambios genéticos y epigenéticos inducidos por el cultivo in vitro. Estudios recientes confirman que, aunque la frecuencia de polimorfismos es generalmente baja, se han detectado modificaciones en la metilación del ADN y ligeros cambios genómicos en regenerantes obtenidos por embriogénesis somática indirecta (Yelli et al., 2023; Majumder  et al. 2025). Estos hallazgos indican que la propagación clonal mantiene una alta estabilidad genética, pero requiere el uso de marcadores moleculares y epigenéticos para garantizar la fidelidad clonal y aprovechar la variación somaclonal como fuente de diversidad en programas de mejoramiento.

Figura 3

Dendrograma SSR obtenido del análisis de agrupamiento UPGMA basado en el índice de similitud Jaccard para los 12 genotipos estudiados del clon PER-183.

 Aunque se ha considerado que las especies propagadas asexualmente son clones genéticamente idénticos, Osorio et al. (2012) demostraron que existe variabilidad genética localizada en regiones no codificantes o repetitivas, generalmente sin impacto fenotípico. Investigaciones recientes en agave confirman este fenómeno, y muestran que la embriogénesis somática puede inducir variaciones somaclonales detectables mediante marcadores AFLP y SSR, además de la caracterización de genes como SERK, lo que subraya la importancia de monitorear la fidelidad genética en programas de micropropagación (Paredes-Ulloa et al., 2023; Reyes-Díaz & Arzate-Fernández, 2024).

Hay factores externos, propios del cultivo in vitro, que pueden inducir acumulación de variaciones genéticas y epigenéticas, que se manifiestan en el fenotipo. Algunos factores externos son: (1) método de cultivo in vitro y patrón de desarrollo, (2) edad del cultivo y subcultivos, y (3) algunos componentes del medio de cultivo (Sánchez- Chang y Jiménez, 2009). En este caso, el uso de 2,4-D y Picloram pudo inducir cierta variación somaclonal, lo cual coincide con lo descrito por García et al. (2019), donde concentraciones elevadas de 2,4-D y Picloram generaron mutaciones y cambios epigenéticos en especies como Glycine max, Carica papaya y Bactris gasipaes demostrados mediante marcadores moleculares. Nuestros resultados mostraron una variabilidad baja, confirmada por el coeficiente de similitud de Jaccard; lo que indica que, aunque existe riesgo de variación, la propagación masiva por embriogénesis somática sigue siendo un proceso confiable en nuestro sistema.

Estudios recientes sobre la estabilidad genética de plantas regeneradas por embriogénesis somática en yuca han confirmado que los clones obtenidos presentan una alta fidelidad genética, con variaciones somaclonales detectadas a muy baja frecuencia mediante marcadores moleculares como AFLP y SSR. Estas variaciones, cuando ocurren, suelen estar asociadas a cambios epigenéticos inducidos por condiciones de cultivo, y tienden a desaparecer una vez que las plantas retornan a un desarrollo fisiológico normal (Ochoa et al., 2012). De manera similar, en caña de azúcar y otros cultivos propagados in vitro se ha reportado la presencia de variabilidad genética, aunque en niveles bajos, lo que confirma que la embriogénesis somática sigue siendo un método confiable para la propagación masiva y la conservación de germoplasma (Majumder et al., 2025).

La inestabilidad genética en cultivos de tejidos in vitro suele estar asociada a respuestas de estrés y pérdida del control celular, manifestándose principalmente en procesos de metilación del ADN y mutaciones. El uso de auxinas sintéticas como 2,4-D y Picloram ha sido vinculado con alteraciones en los niveles de citosina metilada y con la aparición de variación somaclonal, fenómeno confirmado en estudios recientes que destacan el papel de los reguladores de crecimiento y las condiciones de cultivo en la generación de cambios genéticos y epigenéticos (Zavattieri et al., 2010; Linacero & Ballesteros, 2024).

En tal sentido, la aceleración de la división celular en la formación de callos embriogénicos friables y posteriores subcultivos en yuca influye en un aumento de la variación somaclonal (Ma et al., 2015). Plantas con tasas de metilación disminuidas pueden desencadenar anormalidades fenotípicas como enanismo, alteraciones en hojas, fertilidad reducida y cambios en la floración (Finnegan et al., 2000). La regulación epigenética juega un papel clave en la formación del callo embriogénico, afectando la expresión genética mediante modificaciones en la metilación del ADN y en las histonas, fenómeno confirmado en estudios recientes que muestran cómo la exposición a auxinas sintéticas y el tiempo de cultivo pueden inducir cambios epigenéticos en yuca y otros cultivos (Cardone, Olmos & Echenique, 2023; Ochoa et al., 2012; Linacero & Ballesteros, 2024).

Osorio et al. (2012) evaluaron plantas generadas por embriogénesis somática en diferentes estados de desarrollo usando marcadores ISTR, AFLP y SSR, encontrando polimorfismo con ISTR y AFLP, pero no con SSR. Estos resultados mostraron que los perfiles genéticos cambian durante el desarrollo y que la variabilidad se introduce en todos los estados del proceso, aunque puede revertirse cuando las plantas son llevadas al campo. Investigaciones recientes en Agave tequilana y otras especies, confirman este fenómeno, señalando que la embriogénesis somática puede generar variación somaclonal detectable mediante AFLP, pero que la integridad genética se mantiene en gran medida, incluso tras crioconservación, lo que refuerza la confiabilidad del proceso para propagación masiva (Delgado-Aceves y Portillo, 2025).

La micropropagación mediante embriogénesis somática representa una alternativa altamente eficiente para la producción de plantas de yuca. Es fundamental evaluar en campo las plantas obtenidas in vitro, con el fin de identificar posibles variaciones morfológicas o de rendimiento. Esta técnica permite generar un gran número de plantas sanas en un periodo aproximado de seis meses, lo que ofrece a los productores una ventaja significativa frente a la propagación tradicional por estacas. A diferencia del método convencional, donde la disponibilidad de material es limitada y el riesgo de contaminación y transmisión de enfermedades es elevado, la embriogénesis somática asegura mayor uniformidad, rapidez y calidad en la producción, contribuyendo al fortalecimiento y sostenibilidad del cultivo.

Conclusiones

El uso de marcadores moleculares SSR ofrece una alternativa de evaluación de la estabilidad y diversidad genética en cultivares de yuca. De esta manera, se demostró en el clon PER-183 una alta uniformidad genética con un coeficiente de correlación cofenética de 0,799.

La variabilidad genética observada puede atribuirse a variación epigenética producto del proceso de propagación in vitro, entre otros factores.

Por las razones mencionadas anteriormente, el uso de esta técnica puede ser recomendado como alternativa para el análisis de uniformidad y variabilidad genética en plantas propagadas in vitro.