Efecto de dos sistemas de acondicionamiento y almacenamiento en la calidad fitosanitaria y genética de semilla común de caraota (Phaseolus vulgaris L.)

Introducción

Se entiende por semilla de alta calidad, aquella que muestra alto grado de pureza genética, alto vigor y viabilidad, una buena apariencia, mínima presencia de daños mecánicos, grado de madurez idóneo, alto grado de sanidad, contenido de humedad adecuado a la especie de la cual se trate y que permita conservarse fácilmente bajo condiciones estándares de laboratorio (Cerovich y Miranda, 2004). La calidad involucra cuatro componentes estudiados en el ámbito agronómico, el físico que está relacionado con el aspecto general del material vegetal, el fisiológico (germinación, vigor y longevidad), el de sanidad (semilla libre de insectos plaga y de enfermedades) y el genético (pureza e identidad varietal) (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación [FAO y AfricaSeeds], 2019).

En el presente trabajo se hace un análisis de la calidad fitosanitaria, la cual está relacionada con la sanidad de semillas, que viene representada por la incidencia de bacterias, hongos, virus, insectos y nemátodos causantes de enfermedades, lo cual afecta la viabilidad y confiabilidad del material, ya que repercute en su tiempo de vida útil.

La sanidad de semillas, está influenciada por las condiciones climáticas, el manejo y la presencia del inóculo. Los patógenos son causantes del deterioro de la capacidad germinativa de la semilla y la producción de plántulas enfermas que no llegan a la etapa adulta en campo (Gallo et al., 2010).

Este componente es evaluado de forma general en el ámbito industrial; aunque si las empresas o los usuarios, requieren mayores detalles para su estudio, recurren al uso de servicios externos especializados que realizan las diferentes evaluaciones como lo describe la Norma ISTA (2016), debido a que es obligatorio cumplir con algunos requisitos, de acuerdo a la legislación agrícola nacional.

Por otra parte, el componente genético determina la identidad de las semillas de una variedad, lo que permite la comparación con las características de la variedad liberada y descrita por el genetista. Asimismo, en la práctica, este componente es evaluado por la industria mediante la contratación de laboratorios que cuentan con personal y equipos especializados, quienes verifican la pureza varietal y la identidad del material (Boschi, 2010). Es importante dejar claro, que la pureza varietal es la característica que garantiza la homogeneidad comercial del producto, por lo que se espera que las plantas posean las mismas características morfológicas, de producción y ciclo de cultivo; así como de resistencia y/o tolerancia a condiciones desfavorables bióticas y abióticas.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del acondicionamiento y almacenamiento en los sistemas artesanal e industrial, sobre la calidad sanitaria y genética en semilla común de caraota, producida en una unidad de producción del estado Carabobo, Venezuela, y así verificar y comparar los sistemas de producción, y de esa manera demostrar la efectividad de los mismos.

Materiales y Métodos

La presente investigación fue de campo y experimental, lo cual permitió demostrar los efectos del acondicionamiento y almacenamiento sobre la semilla común de caraota (Hurtado de Barrera, 2012). Se desarrollaron una serie de acciones de evaluación directa de los sistemas artesanal e industrial, en las que se determinó como las operaciones aplicadas en cada lote afectan la sanidad, la pureza varietal y la identidad genética de la semilla.

El material vegetal fue identificado por el agricultor como cultivar Magdaleno, quien destinó 2200 kg de la producción para la propagación en el siguiente ciclo de siembra. Este material vegetal provino de una pequeña unidad de producción ubicada en San Joaquín, estado Carabobo, Venezuela. El lote, fue dividido en dos partes iguales y envasados en sacos de 25 Kg, obteniéndose 44 sacos de semilla. De cada lote, se seleccionaron cinco muestras compuestas de 3 kg (cada una provino de la selección aleatoria de 15 sacos, siempre distintos, de los que se extrajeron 200 g de semilla). El muestreo se realizó siguiendo el protocolo reportado por Díaz et al. (2024).

De cada muestra compuesta, se destinaron 400 g para realizar las pruebas de calidad fitosanitaria y 200 g para los ensayos de pureza varietal e identidad genética. Las pruebas de calidad fitosanitaria se realizaron en la Clínica de Enfermedades de Plantas del Instituto de Botánica Agrícola, mientras que las de pureza varietal e identidad genética se desarrollaron en el Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola (CIBA), ambas instancias adscritas a la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela (UCV).

Para la prueba de sanidad, se determinó el porcentaje de semillas afectadas por F. oxysporum f. sp. Phaseoli y Aspergillus spp. Para conocer la identidad del cultivar y la pureza genética, se evaluaron tres sistemas isoenzimáticos (alfa y beta esterasa y peroxidasa). Para cada caso, los procedimientos de laboratorio se describen a continuación.

Experimento de sanidad

De cada muestra de 400 g se tomaron tres repeticiones, realizando una selección aleatoria de 375 semillas de los sistemas artesanal e industrial para detectar la incidencia (%) de los patógenos ya mencionados, aplicando el método del papel secante (blotter test) (ISTA, 2016). Todos los materiales fueron esterilizados, siguiendo los protocolos estandarizados en el laboratorio.

En placas plásticas de Petri de 12 cm de diámetro, fueron colocadas dos láminas de papel secante cortadas en forma de discos, luego se agregaron 10 mL de agua destilada estéril para posteriormente, ubicar de forma equidistante 25 semillas. En total, se usaron 15 cápsulas por sistema, las cuales se taparon y se llevaron a cámara húmeda por 24 h. Posteriormente, las placas se transportaron en bolsas plásticas a un congelador de -20°C por 24 h para inhabilitar el crecimiento de la radícula, inhibir la germinación y evitar contaminación cruzada entre semillas. Las placas se llevaron a cámara húmeda previamente desinfectada con alcohol al 70% v/v, en la que se dejaron durante cinco días a 25 ± 2°C y 70% – 75% de humedad relativa.

Se observaron bajo la lupa estereoscópica, y se cuantificó el porcentaje de semillas infectadas por F. oxysporum f. sp. Phaseoli y Aspergillus spp. Para las identificaciones a nivel de género, se siguieron los criterios taxonómicos descritos por Ellis (1971), Nelson et al. (1983) y Sutton (1980), con base en las estructuras reproductivas observadas con la lupa y el microscopio a 40X, usando colorantes vegetales como medio de montaje (González et al., 2011). Los resultados se presentaron en micrografías.

Desde el punto de vista analítico, se aplicó la prueba de Wilcoxonn-Mann-Whitney de dos colas, dada la naturaleza de la variable respuesta (incidencia), y el hecho de que los datos fueron tomados de manera independiente y de forma aleatorizada. Dicha prueba permitió comparar el rango medio de los dos sistemas de acondicionamiento y almacenamiento, para así poder indicar si existían diferencias estadísticamente significativas al 5% entre ellas. Las hipótesis probadas fueron: (H₀): no existen diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de los sistemas analizados, versus la hipótesis alternativa (H_a): existen diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de los sistemas analizados.

Para la incidencia de Aspergillus spp., se aplicó la prueba t de student para determinar la diferencia de las medias de dos poblaciones independientes de muestras pequeñas y con varianzas desconocidas, aunque se asume que éstas son iguales (Hines y Montgomery, 1996; Montgomery y Runger, 2003). Los resultados estadísticos se presentaron en cuadros de doble entrada.

Para todos los casos, se aplicó como regla de decisión que si el p valor de la prueba era menor que el nivel de significancia (α = 0.05), se declararon diferencias estadísticamente significativas entre los sistemas de acondicionamiento y almacenamiento. Los análisis se realizaron con el paquete estadístico Minitab® v. 2019.

Experimento de pureza varietal e identidad genética

Para esta experiencia fueron elegidas aleatoriamente tres de las cinco muestras compuestas por cada lote, siendo estas los materiales problema a las que se les verificó la pureza varietal, además fueron utilizados dos materiales de referencia para determinar la identidad genética; siendo ellos Magdaleno y UCV Manuare, suministrados por el CIBA.

El material vegetal a usar en este experimento, se sembró bajo condiciones de laboratorio en las que se usaron 25 semillas de cada uno de los materiales de referencia y 120 semillas de cada uno de los materiales problemas, todos separados e identificados en sus cámaras de siembra. A los siete días, se colectaron las plántulas de las cuales, se realizó el macerado para extraer su savia.

Posteriormente, se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida con los tres sistemas izoenzimáticos evaluados, para lo cual se maceró el tejido en tampón de extracción a pH 7,8 (0,5 g de glutatión a 4ºC, 5 mL de Tris 0,1 M pH 8, 40 mL de agua destilada estéril (ADE)) y se sometió a un campo eléctrico durante 2 horas hasta lograr que las enzimas se separaran debido al efecto de sus cargas eléctricas. La preparación de las soluciones se realizó siguiendo los protocolos de Pérez (2021).

Se utilizaron las isoenzimas, debido a que son marcadores genéticos más eficientes que los morfológicos, son fáciles de desarrollar a nivel de laboratorio debido a su simplicidad de empleo, son de bajo costo, además de que permiten igualar al fenotipo de su genotipo.

En relación con la preparación de las muestras para la electroforesis, se pesó en una balanza 10 g de plántulas seleccionadas aleatoriamente. Cada muestra fue colocada en morteros fríos a -20°C, a las que se les agregó 5 mL de tampón de extracción. Se maceró vigorosa y rápidamente para evitar que las muestras llegaran a temperatura ambiente. En ocho viales de 1000 μL previamente identificados, se colocó 500 μL de la solución macerada.

Para la electroforesis, se tomaron 20 μL de solución macerada a la que se le agregaron 2 μL de azul de bromofenol (diluido en glicerol), y se colocaron en cada pozo de siembra del gel. Se fijaron como condiciones de corrida en la fuente de poder los valores de 40 A y 100 V, y se realizó el procedimiento hasta que el frente de corrida llegase al final del gel. Durante esta fase, se agregó agua destilada constantemente para evitar resequedades en el gel, y así garantizar que la electroforesis se realizara de forma continua.

Finalizada la electroforesis, se agregó a los geles una solución de revelado (11,2 g de fosfato de sodio monobásico (NaH₂PO₄) en 600 mL de ADE y 2,6 g de fosfato disódico (Na₂HPO₄) en 200 mL de ADE, pH 6,3) de acuerdo con cada sistema enzimático. Las bandejas se incubaron a 37ºC hasta que se lograron visualizar las bandas. Los geles se lavaron con una solución de fijación (metanol más ácido acético glacial) y se llevaron al transiluminador para la toma de fotografías.

La interpretación de los resultados se realizó de forma cualitativa, en la que se desarrolló una matriz de código binario de bandas (datos dicotómicos o de doble estado, 0: ausente y 1: presente). A partir de esta información se establecieron los patrones electroforéticos para los materiales de referencia y las muestras problema, siendo éstas las unidades de caracterización. Estadísticamente, se aplicó el método multivariado para la determinación de la distancia de Jaccard (agrupamientos por clúster), lo cual permitió obtener un gráfico de árbol o dendograma, en el que se presentó de manera resumida la similitud entre las unidades básicas de caracterización, tal como lo señalan Núñez-Colín y Escobedo-López (2011). Los datos se analizaron utilizando el programa Infostat® v. 2020.

Resultados y Discusión

Ensayo de sanidad

A nivel de microscopía, se logró determinar los macroconidios de F. oxysporum f. sp. Phaseoli y la cabeza conidial típica de Aspergillus spp (figura 1A y 1B, respectivamente). Por tanto, se señala que la microbiota detectada en el presente estudio, es similar a la reportada en otras investigaciones (Díaz y Tello Marquina, 1994; Groenewold-Labrada et al., 2003; Permuy Abeleira et al., 2008; Escalona et al., 2017).

Figura 1

Micrografia (40X) de F. oxysporum f. sp. Phaseoli (A) y Aspergillus spp (B).

El patógeno F. oxysporum f. sp. Phaseoli, fue observado en los lotes de semillas artesanal e industrial, con incidencias de 54,15% ± 2.69% y 21,37% ± 2,13%, respectivamente (cuadro 1). Estadísticamente, no se cumplió el supuesto de normalidad (p – valor < 0,05), y si se corroboró el supuesto de homogeneidad de varianzas (p – valor > 0,05). Por su parte, se lograron determinar diferencias significativas entre sistemas (p valor <0,0001) (cuadro 1). Groenewold-Labrada et al. (2003), señalan que incidencias entre 0 a 10% pueden ser consideradas bajas, entre 11 a 30% en la categoría de incidencia intermedia, y valores superiores a 31% como incidencia elevada. Por tanto, la incidencia a nivel de campo fue alta.

Tales resultados concuerdan con los obtenidos por los autores antes mencionados, quienes detectaron la incidencia F. oxysporum f. sp. Phaseoli con valores superiores al 40% en campos mexicanos. A nivel industrial se determinó una incidencia intermedia (21,37% ± 2,13%). Tales resultados, se deben a la forma de almacenamiento en cada uno de los sistemas. Adicional a lo anterior, el Fusarium produce micotoxinas, que plantean diversas toxicidades para los seres humanos y/o los animales después del consumo de grano contaminado (Ekwomadu et al., 2021).

Cuadro 1

Incidencia de F. oxysporum f. sp. Phaseoli en semilla común de caraota bajo dos sistemas de acondicionamiento y almacenamiento.

En relación con Aspergillus spp., se logró observar la cabeza conidial característica del género, pudiendo corresponderse con las especies A. flavus Link, A. niger Van Tieghem, A. oryzae (Ahlburg), A. ochraceus Wilhelm, A. terreus Thom, A. candidus Link o A. versicolor (Vuill.) Tira Boschi, según los resultados sugeridos por Escalona et al. (2017). Aspergillus spp, es un moho toxigénico frecuentemente observado en granos de caraotas que han estado almacenados en cavas. Las mismas fueron observadas en mayor incidencia en el sistema industrial (7,33% ± 0,58%), que en el artesanal (3,01% ± 0,80%); y estadísticamente, se demostró el cumplimiento del supuesto de normalidad (p – valor >0,05), de independencia, aleatoriedad y de homogeneidad de varianzas (p – valor >0,05), detectandose diferencias estadísticamente significativas entre los lotes (p valor <0,0001) (cuadro 2). Es importante destacar, que incidencias menores a 15% son consideradas bajas, según los criterios de evaluación sugeridos por Mazzani (1998).

Cuadro 2

Incidencia de Aspergillus spp, en semilla común de caraota bajo dos sistemas de acondicionamiento y almacenamiento.

Es importante señalar que la presencia de especies del género Aspergillus son de especial interés, ya que en éste se ubican la mayoría de los mohos con capacidad de sintetizar micotoxinas (Escalona et al., 2017). La presencia de Aspergillus spp. se debe a un mal manejo integrado de los granos y semillas a nivel industrial, malas condiciones de almacenamiento, transporte inadecuado y la presencia de insectos que sirven como medio de transporte para microorganismos (Escalona et al., 2017).

También es importante destacar, que el material vegetal objeto de estudio se usa bajo la modalidad “doble propósito”, como grano para la venta a granel y como semilla, razón por la cual es pertinente profundizar en este resultado, ya que este tipo de patógenos alteran la composición nutricional y comercial del grano y ponen en riesgo la salud de los consumidores. Adicional a lo anterior, se resalta que la caraota es un excelente sustrato para el crecimiento de mohos, y que el sistema industrial provee mejores condiciones para su proliferación, tal y como lo resaltan Escalona et al. (2017).

Experimento de pureza varietal e identidad genética

La pureza e identidad, son elementos fundamentales que debe ostentar una semilla de alta calidad. La misma se interpreta como la correcta proximidad genética entre los miembros que conformarán a la futura población de campo (FAO y AfricaSeeds, 2019). En otro orden de ideas, estas determinaciones no son comunes de aplicar, sobre todo en las semillas locales y comunes (Araya et al., 2010; ISTA. 2016). De lo que no hay duda, es que poseer un material correctamente identificado en términos genéticos, da garantía de partida de que la respuesta del potencial biológico de la planta se alinee con la producción en campo, lo que podría representar el éxito de una correcta producción de alimentos.

En relación con los resultados obtenidos en el presente estudio, se destaca que de los tres sistemas enzimáticos estudiados, alfa y beta esterasas fueron los que mostraron mayor polimorfismo (figura 2A y 2B). Resultados similares fueron reportados por Salazar et al. (2011) para aislados del hongo Trichoderma spp.

Con respecto al análisis de agrupamiento, se establecieron claramente tres grupos: el primero conformado por el cultivar ´UCV Manuare´, el segundo por el cultivar ´Magdaleno´ y el tercero por las muestras problemas (artesanal 1, 2 y 3 e industrial 1, 2 y 3), lo que evidencia que en las unidades básicas de caracterización se conformó una constitución isoenzimática similar, mezcladas entre sí, que no guardan relación alguna con los materiales de referencia usados en el experimento (Figura 3).

Es evidente que los grupos determinados en el dendograma, sugieren que las muestras problema, al ser comparadas con el cultivar indicado verbalmente por el productor (Magdaleno), no presentaron similitudes hacia este. Por tanto, se observó que la población de semilla común de caraota existente en la unidad de producción es heterogénea desde el punto de vista isoenzimático, lo cual muy probablemente está ligado a la segregación morfológica y genética, motivo que conlleva a señalar que no se logró determinar la pureza varietal y la identidad genética del cultivar objeto de estudio.

Figura 2

Patrón de bandas de electroforesis en geles de acrilamida en tres sistemas isoenzimáticos. A: α esterasa, B: β esterasa, C: Peroxidasa

Nota. Carriles en los geles: 1) Cultivar ‘Magdaleno’, 2) Cultivar ´UCV Manuare´, 3 al 5) lote artesanal (muestras 1, 2 y 3) y 6 al 8) lote industrial (muestras 1, 2 y 3).

Figura 3

Dendograma con base en el índice de similitud de Jaccard en varios lotes de semilla común de caraota.

Dicho resultado puede deberse a tres posibles eventos, el primero, que el agricultor haya realizado un intercambio deliberado de semillas, lo cual es una práctica frecuente en pequeñas unidades de producción, el segundo es que el material se haya sometido a muchos ciclos de multiplicación, lo que resulta en un aumento de la contaminación, cruce y variabilidad en la población. En este aspecto, la FAO y AfricaSeeds (2019) señala que los agricultores deben restringir el número de generaciones en su material de propagación para evitar ese tipo de situaciones. El tercero, es que haya ocurrido contaminación física o mecánica debido a un manejo inadecuado durante las labores de campo, cosecha, procesamiento y almacenamiento.

Es evidente que los problemas de identidad y pureza provienen inicialmente desde el campo, y que pueden agravarse si a nivel industrial se procesan otros lotes del mismo cultivo con identidades diferentes en las que las labores de limpieza de las maquinarias son realizadas de manera incorrecta, de allí, que en el ámbito industrial las operaciones de limpieza deben realizarse de manera estricta.

Conclusiones

La semilla común, independientemente del cultivo, no está sujeta legalmente a recibir el seguimiento de los organismos oficiales para evaluar su calidad, razón por la cual normalmente no se verifican aspectos fundamentales como la fitosanidad, pureza varietal e identidad genética en campo ni en laboratorio

Con respecto a la sanidad, el patógeno F. oxysporum f. sp. Phaseoli, fue observado tanto en los lotes de semilla artesanal e industrial, con mayor incidencia en la semilla acondicionada y almacenada de forma artesanal, lo que puede derivar en futuros ataques de marchitez vascular.

El moho toxigénico Aspergillus spp. fue detectado en ambos sistemas; pero con mayor incidencia en el industrial, aunque dicho valor es considerado bajo. Cabe destacar que su presencia debe ser analizada con mayor detalle, ya que el lote es usado por el agricultor como grano/semilla.

Los estudios isoenzimáticos permitieron establecer que la población de semilla común de caraota existente en la unidad de producción es heterogénea, pero no se logró determinar su pureza varietal ni su identidad genética.

Según la información recolectada en el presente estudio, se verificó que la sanidad está influenciada por la forma en que se acondiciona y se almacena la semilla común de caraota. Asimismo, se comprobó que las labores de campo afectan negativamente la identidad y pureza de un cultivar, lo cual pudiera acrecentarse si ocurren contaminaciones durante el procesamiento industrial.

Agradecimientos

Los autores desean expresar su agradecimiento al Sr. Eduardo Pérez dueño de la Unidad de Producción Finca Valle Hermoso, al Ing. José Zamora y su personal del Laboratorio de Calidad de PROSEVENCA, a los profesores Yonis Hernández, Catalina Ramis, Rafael Mejías, Julio Salazar, Dhoryvel Cabrera, José Díaz e Yreny De Faria. También se reconocen los aportes de la Ing. Liadamith Ángel y del bachiller Rodrigo Angulo.