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Inducción de callos embriogénicos en Musa AAB cv. ‘plátano Hartón’ a partir de explantes de multimeristemos
2Profesional de Investigación de la Unidad de Biotecnología Vegetal, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA-CENIAP), Edificio 2, Av. Universidad, vía El Limón. Maracay, Venezuela.
3Profesor e Investigador Asistente del Departamento e Instituto de Genética, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela-Campus Maracay, Av. Universidad, vía El Limón. Maracay, Venezuela.
La embriogénesis somática es un método confiable para la propagación masiva de plantas, caracterizado por fases morfogénicas específicas, siendo una de las más importantes la formación de callo friable embriogénico y libre de fenoles. El objetivo de esta investigación fue evaluar tres concentraciones de picloram (4-Amino-3, 5,6-Trichloro picolinic acid) en explantes de multimeristemos de plátano Hartón para obtener callo embriogénico. Se utilizaron multimeristemos de 63 días como explantes iniciales para inducir callo embriogénico friable de Musa AAB, en medio Murashigue y Skoog (1962) más vitaminas. Las concentraciones de picloram fueron: 0,0; 1,8 y 2,0 mg.L-1. Los explantes se mantuvieron a temperatura ambiente de 28±2 °C y bajo luz de 50 µmol.m–2.s-1 hasta la formación de callo compacto a los 75 días del cultivo. Posteriormente, el callo se dividió en varias secciones para inducir múltiples fragmentos con masas de células proembrionicas, que originaron estructuras multicelulares organizadas. Las variables evaluadas fueron el porcentaje de callo y el porcentaje fenoles, con diez repeticiones por tratamiento. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante un diseño completamente al azar y se aplicó la prueba de comparación entre medias de Duncan (p ≤ 0,01). El mayor porcentaje de callo embriogénico se obtuvo con 2 mg.L-1 de picloram, alcanzando un 31,8% de callo color blanco – cremoso. El tiempo total de producción de callo embriogénico fue de 198 días. Esta estrategia facilitó la formación de callo embriogénico, iniciando así la embriogénesis somática para la regeneración in vitro de plantas.
Somatic embryogenesis is a reliable method for mass plant propagation, characterized by specific morphogenic phases, one of the most important being the formation of embryogenic and phenol-free friable callus. The objective of this research was to evaluate three concentrations of picloram (4-Amino-3, 5,6-Trichloro picolinic acid) in explants of plantain Hartón multimeristems to obtain embryogenic callus. Sixty-three-day-old multimeristems were used as initial explants to induce friable embryogenic callus of Musa AAB, on Murashigue and Skoog (1962) medium plus vitamins. The concentrations of picloram were: 0,0; 1,8 and 2,0 mg.L-1. The explants were maintained at room temperature of 28 ± 2 °C and under light of 50 µmol.m–2.s-1 until the formation of compact callus at 75 days of culture. Subsequently, the callus was divided into several sections to induce multiple fragments with masses of proembryonic cells, which gave rise to organized multicellular structures. The variables evaluated were callus percentage and phenol percentage, with ten replicates per treatment. The results were statistically analyzed using a completely randomized design and the Duncan’s test for comparison between means was applied (p ≤ 0.01). The highest percentage of embryogenic callus was obtained with 2 mg.L-1 of picloram, reaching 31,8% of white-creamy callus. The total embryogenic callus production time was 198 days. This strategy facilitated embryogenic callus formation, thus initiating somatic embryogenesis for in vitro plant regeneration.
Introducción
Las musáceas comestibles (plátanos o bananos) son uno de los cultivos más importantes del mundo, consumidos por más de 400 millones de personas (FAO, 2019; Dita et al., 2018) debido a su valor nutritivo y como alimento básico en los países en desarrollo. En las últimas décadas, la producción mundial de musáceas ha experimentado un aumento continuo de su consumo fresco; así como de sus derivados industriales.
En el caso particular del plátano Hartón, su producción es importante por sus múltiples aplicaciones. Los frutos verdes, maduros y residuos de postcosecha se usan para alimentos humanos y animales, manufacturas, y productos como detergentes, papel, pinturas, adhesivos, cerámicas, biopolímeros, textiles, cosméticos y pañales (Albarado y Palmiro, 2020). Asimismo, la harina de plátano es nutritiva y se utiliza en diversos alimentos y bebidas (Robles López, 2023; Zambrano Muñoz, 2018). Estos derivados tienen alta demanda y son económicamente rentables (Mercado Osorio y Hoyos Caldera, 2020).
El plátano Hartón es una planta robusta con un pseudotallo de más de 3 m y hojas verde oscuro con nervaduras verdes claro con hábito foliar dístico y miden menos 2,5 metros. La planta produce de tres a cinco hijos. Los plátanos son polimórficos, pudiendo generar de dos a veinte manos con dos a veinte dedos por racimo. La producción y vigor de las plantaciones varían según el manejo agronómico, y factores ambientales, nutricionales, fertilización y riego, así como la interacción del sistema suelo-planta (Acosta, 2021; Olivares et al., 2020; Rodríguez et al., 2018, IPGRIP-INIBAP/CIRAD, 1996).
La producción de plátano Hartón en Venezuela fue de 663263,16 t; y cuenta con un rendimiento de 10041,9 kg.ha-1 y una superficie de siembra de 57918 ha. Los estados con mayor producción se encuentran al sur del Lago de Maracaibo, en la zona conformada por los estados: Zulia, Mérida, Táchira y Trujillo (FAOSTAT, 2022; Martínez-Solorzano et al., 2021).
Ahora bien, su producción presenta limitaciones de tipo fitosanitario como el Moko (Ralstonia solanacearum), la Sigatoka negra (Micosphaerella fijiensis) y las implicaciones de riesgo para la marchitez por Fusarium raza cuatro tropical (Fusarium oxysporum f. sp. Cubense, raza 4 tropical, FocR4T) (Martínez et al., 2023).
La aparición y expansión de la marchitez por Fusarium oxisporum f. sp. Cubense, raza 4 tropical y otras enfermedades de tipo fungoso; así como el ataque por virus, insectos y nematodos, han ocasionado la disminución en la producción y productividad en las plantaciones, disminuyendo el rendimiento y causando pérdidas de ganancia de banano (Musa AAA), plátano (Musa AAB) y topocho (Musa ABB) en países altamente productores: India, China, Indonesia y Filipinas, Tailandia en el continente asiático; Gana, Malawi, Nigeria, Sudan y Kenya del continente africano; y Ecuador, Brasil, Guatemala, Costa Rica y México para América Latina y el Caribe (Martínez et al., 2023; Álvarez-Morales et al., 2020; FAOSTAT, 2022).
En Venezuela, la producción de Musa AAB cv. ‘plátano Hartón’ enfrenta desafíos significativos debido a factores bióticos y abióticos que afectan la calidad de las semillas. En este contexto, la embriogénesis somática emerge como una estrategia crucial para la propagación masiva de plantas de alta calidad genética. Este método permite la producción eficiente de un gran número de plantas uniformes y saludables, lo que a su vez potencia significativamente la productividad del cultivo. Al centrarse en la embriogénesis somática, se puede asegurar un suministro continuo y abundante de plántulas de calidad, optimizando así el rendimiento y la estabilidad del plátano Hartón en el país (Justine et al., 2022; Vangrapandu Viswanath y Roy, 2021; Galan et al., 2018; Idacochea et al., 2017).
Los plátanos se propagan convencionalmente por medio de división de cormos, este procedimiento es lento para su multiplicación y a menudo existe el riesgo de contaminación con plagas y enfermedades. Por lo que esta técnica de propagación no resulta eficiente para satisfacer la demanda de plantas en los diferentes mercados.
Una alternativa confiable de obtención de plántulas es la micropropagación, a diferencia del sistema de producción convencional de material de banano y plátano, este es un procedimiento para producir plantas sanas y libres de enfermedades durante todo el año, con un mejor rendimiento en condiciones de campo y expresando su potencial genético (Abdalla et al., 2022; Ledezma Rodríguez, 2019).
La embriogénesis somática es una técnica del cultivo in vitro para el establecimiento de un sistema de propagación masiva aplicada en plátanos y bananos. Es importante la obtención de callo de calidad fisiológica y con baja incidencia de formación de fenoles que contribuya al éxito de embriogénesis somática. Una modificación al medio de inducción de callos es la incorporación de picloram (acido4-amino-3,5,6-tricloro picolinico) (Pic) y ha sido utilizado con éxito para inducir callo embriogénico friable en otros cultivos (Hernández-Jeréz et al., 2022). El Pic es una auxina sintética muy eficiente para el cultivo de tejidos vegetales y ofrece ciertas ventajas, entre ellas: es soluble en agua, menos tóxico por su efectividad a concentraciones más bajas y proporciona un mayor potencial para la regeneración de plantas a partir de callos. Se ha reportado, como un potencial agente embriogénico, como una alternativa en la composición de fitorreguladores del medio de inducción de callos embriogénicos y generador en el proceso de morfogénesis (Hernández-Jeréz et al., 2022; Galan et al., 2018).
El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de diferentes concentraciones de picloram en presencia de dos citocininas para la producción de callo con baja afectación por fenoles en explantes de multimeristemos.
Materiales y Métodos
El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agrícola (CIBA), Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela (UCV), Campus Maracay.
Material vegetal
Se usaron cormos de 25-30 cm de longitud del cultivar plátano Hartón Musa AAB, extraídos del Banco de Germoplasma del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP) del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Maracay, estado Aragua. Los cormos fueron cortados hasta 4 x 5 cm (figura 2) y lavados con jabón líquido neutro, seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril (ADE). Seguidamente, se sumergieron en alcohol etílico al 70% durante 1 min y tres lavados con ADE. Posteriormente, se colocaron en hipoclorito de sodio al 3% durante 30 min y finalmente se lavaron tres veces con ADE. A partir de los cormos, se obtuvieron ápices meristemáticos de 3 x 3 cm
Procedimiento experimental
El procedimiento experimental para la inducción de callo embriogénico de plátano Hartón, constó de tres etapas: I) Etapa de iniciación en medio basal de inicio, II) Etapa de formación e inducción de multimeristemos o scalps y III) Etapa de inducción de callo (figura 1).
Figura 1
Esquema del procedimiento para la obtención de callos embriogénicos en plátano Hartón.
- Etapa de iniciación en medio basal
Los explantes de ápices de 3 x 3 cm de plátano Hartón se colocaron en el medio de cultivo correspondiente a la fase de establecimiento en medio basal, que contenía las sales de Murashigue y Skoog (1962), suplementado con 500 mg.L-1 de ácido cítrico; 400 mg.L-1 caseína hidrolizada; 0,18 mg.L-1 AIA, 3,20 mg. L-1 6-BAP; 30 g.L-1 sacarosa y 2,5 g.L-1 phytagel. El medio fue ajustado a un pH 5,8 y esterilizado a 121°C y 15 PSI durante 20 min en autoclave marca Esterilmatic, marca Force/IND.INC/USA. Los explantes se colocaron en oscuridad durante 15 días a una temperatura ambiente 28 ± 2°C (figura 2).
Figura 2
Etapa I: Iniciación del cultivo in vitro de ápices de plátano Hartón.
- Etapa de inducción y formación de multimeristemos
Los explantes de multimeristemos de Plátano Hartón fueron sembrados en medio Murashigue y Skoog (1962), suplementado con 0,16 mg.L-1 de AIA; 4,0 mg.L-1 de BAP; 0,16 mg.L-1 de GA3 y 0,10 mg.L-1 de TDZ (Msogoya y Mwakisitu, 2014; Sadik et al., 2007). Los explantes se colocaron condiciones de luz del día (600 lux aprox.) y a temperatura ambiente 28 ± 2°C (figura 3).
Los multimeristemos se obtuvieron a los 63 días de iniciado el cultivo y fueron seleccionados como explantes, realizando incisiones en la masa del explante inicial.
Figura 3
Etapa II: Inducción y formación de multimeristemos a partir de ápices de plátano Hartón.
III. Etapa de inducción de callo
La inducción de callo fue realizada en medio Murashige y Skoog (1962) más vitaminas: 1 mg.L-1 de thiamina HCL; 1 mg.L-1 de piridoxina HCL; 1 mg.L-1 de ácido nicotínico; 100 mg.L-1 de myo-inositol; 2 mg.L-1 de glicina; 400 mg.L-1 de caseína hidrolizada; 50 mg.L-1 de espermidina; 500 mg.L-1 de ácido cítrico; 30 g.L-1 de sacarosa y 3 g.L-1 de phytagel. El medio fue ajustado a un pH 5,8 y esterilizado a 121°C y 15 PSI durante 20 min.
Se establecieron tres tratamientos con tres concentraciones de picloram sugeridas por Marroquín Tornoe (1991): 0,0 (T0); 1,8 (T1) y 2,0 mg.L-1 (T2), además de 1,0 mg.L-1 de 2ip y 0,05 mg.L-1 de TDZ. Se usaron estas citocininas para reemplazar la Zeatina en los medios de cultivo para inducir callos embriogénicos y formar embriones somáticos (IPGRIP-INIBAP/CIRAD, 1996).
Los explantes fueron colocados en condiciones de luz del día tenue (1600 lux aprox.) a una temperatura ambiente de 28 ± 2°C.
El tejido de multimeristemos de 0,5 mm cultivado en el medio de cultivo de inducción de callo manifestó engrosamiento en los primordios foliares a las tres semanas de ser colocado en el medio de inducción (figura 4), una masa de callo compacta de 2 cm se formó a los 75 días de cultivo (figura 5).
Figura 4
Explante multimeristemo de tres semanas presentando engrosamiento e iniciando desdiferenciación (vista ampliada microscopio Leica 40X).
Por otra parte, el callo compacto fue seccionado en fragmentos para mayor cantidad de callo embriogénico friable en 198 días (figura 5).
Figura 5
Etapa III: Formación de callo embriogénico a partir de explantes de multimeristemos en plátano Hartón.
Diseño experimental
Se estableció un diseño completamente al azar con tres tratamientos de picloram (0,0; 1,8 y 2,0 mg.L-1) y 10 repeticiones por tratamiento para un total de 30 unidades de observación. Los datos recolectados para evaluar tanto el porcentaje de formación de callo (%FC) como el porcentaje de fenoles (%F). Se realizaron observaciones semanales donde se registró el número de tubos que mostraron desdiferenciación celular para la formación de callo en relación al total de tubos en el ensayo. Para el porcentaje de fenoles, también se llevaron a cabo evaluaciones semanales después de la siembra inicial, tomando en cuenta el número de tubos con callo afectado por fenoles, comparado con el total de tubos del ensayo, utilizando escala 1 – 100%.
Los datos obtenidos de las observaciones fueron ingresados en una base datos hoja Microsoft Excel, donde se colocaron los tratamientos (protocolos de cultivo in vitro) en filas y las variables en columnas. El análisis fue realizado con el programa estadístico Infostat versión 2020 para obtener los resultados de la estadística descriptiva y realizar el análisis de la varianza. En aquellos casos donde se detectó diferencias estadísticamente significativas (p ≤ 0,05) se aplicó la prueba de comparación entre medias de Duncan.
Resultados y Discusión
En la estadística descriptiva al realizar la prueba de comparación entre medias de Ducan, el mayor porcentaje de callogénesis en los explantes de segmentos de multimeristemos se registró en T2 con un 31,80%; seguido del T1 con 28,10%; mientras que el tratamiento control no mostró formación de callo (cuadro 1).
Cuadro 1
Prueba de comparación entre medias de Duncan del porcentaje de formación de callos (%FC) y el porcentaje de fenoles (%F) en medios con la incorporación de tres concentraciones de picloram, para la inducción de callo embriogénico en explantes de multimeristemos de plátano Hartón.
| Medias | ||
| Tratamiento | %FC | %F |
| T0 | 0,00c | 34,40c |
| T1 | 28,10b | 57,70a |
| T2 | 31,80a | 50,50b |
En el tratamiento T0 no se observó la formación de callo en ninguna de las repeticiones, el %F fue el más bajo registrado en el ensayo, con una media de 34,40%. El T1 presentó una media de 28,10% para el %FC y 57,70 %F, mientras que el T2 registró la mayor media de 31,80 %FC (altamente significativo) y el 50,50 %F. De acuerdo a la información del análisis estadístico, el T2 fue el más efectivo para la inducción callo. Esto queda referenciado en la figura 6 de resumen del proceso de la formación de callo desde su inicio.
Figura 6
Resumen del proceso de inducción de callo embriogénico de plátano Hartón.
El proceso de inducción de callo como punto inicial de la propagación masiva de plátano Hartón a partir de multimeristemos como explante en el presente trabajo se detalla en varios pasos críticos. A los 63 días de cultivo, se observa la formación de multimeristemos en un medio selectivo (A). Posteriormente, se selecciona un explante de multimeristemos de 0,5 mm (B) y se procede a la selección del explante óptimo (C). Este explante se siembra para la inducción de callo (D), formándose un callo compacto a los 75 días de cultivo. Dicho callo compacto se divide para inducir la formación de múltiples callos embriogénicos (F). A continuación, un segmento de callo comienza a formar una masa celular proembriónica (G), que evoluciona en callo multicelular a los 45 días de haber sido dividido el callo compacto (H). Finalmente, a los 198 días, se observa el desarrollo de un callo embriogénico friable (I), esencial para la propagación eficiente mediante embriogénesis somática para la producción de plantas de plátano Hartón.
Estos resultados similares a los reportados por López Santos et al. (2024) en la inducción de callo con estructuras proembriónicas de Sideroxylon capiri (A.D.C) Pittier, al incorporar picloram al medio Murashigue y Skoog (1962). En su ensayo utilizaron dos dosis de picloram: medio lN1 (suplementado con 1.50 mg.L-1 de picloram) y medio lN2 (suplementado con 2,00 mg.L-1 de picloram), siendo este el mejor estadísticamente.
Se observó el efecto de picloram y thidiazuron en la proliferación de masas proembrionicas en los callos inducidos con estos reguladores del crecimiento. El picloram por lo general ha sido utilizado como herbicida. Sin embargo, se han reportado efectos positivos en la inducción de callo para la producción de metabolitos (Genady, 2017); la organogénesis en combinación con citocininas (Gladfelter et al., 2020), y en la inducción de embriogénesis somática indirecta in vitro (Dai et al., 2015).
La aplicación exógena de auxinas induce la respuesta embriogénica, asociada a la actividad de genes de biosíntesis de IAA y al mismo tiempo, se activan los genes de transporte PIN, lo que provoca una acumulación diferencial de IAA en los proembriones formados. Esto influye en el desarrollo de los estadios del embrión somático hasta la formación de la nueva planta (Méndez-Hernández et al., 2019).
La efectividad de concentraciones moderadas de picloram en la inducción de callos para la inducción posterior de embriogénesis somática ha sido comprobada en investigaciones recientes con resultados similares a los obtenidos en el presente trabajo, como ha sido señalado por Chib et al. (2020) en la inducción de embriogénesis somática al cultivar cormos de Crocus sativus; Silvera et al. (2020) al inducir en segmentos de hoja de Plinia peruviana y Almeida et al. (2020) en explantes de hojas de E. guianensis.
Por otra parte, el thidiazuron es un regulador usado como defoliante (Dianani et al., 2018). El thidiazuron es de los más potentes y presenta efectos en las plantas tanto de auxina como citocinina, si se compara con otros reguladores del crecimiento. Esto explicaría su versatilidad en aplicaciones in vitro e in vivo, incluyendo la prevención de la degradación de la clorofila; el aumento de la actividad fotosintética, lo que posiblemente podría contribuir a la inducción de callo y la proliferación de embriogénesis somática (Dianani et al., 2018).
Al comparar thidiazuron con otras citocininas, ha sido señalado que este regulador causa una alteración en el desarrollo de células meristemáticas, en forma más dirigida. Además, al ser resistente a la citocinina oxidasa, lo convierte en un compuesto estable en el cultivo in vitro (Pérez-Chaves, 2020).
En el presente estudio el thidiazuron posiblemente fue efectivo en la inducción de callo proembrionico y permitió una respuesta embriogénica en combinación con picloram en el cultivo de explantes de multimeristemas. En este orden de ideas, Pérez-Chaves (2020) concluyó su efectividad en la proliferación de callo embriogénicos de Hyeronima alchorneoides, con dosis de 8,28 µM (1,999mg.L-1 ≈ 2,00 mg.L-1) de picloram y 4,54 µM (1,000 mg.L-1 ≈ 1,00 mg.L-1) de thidiazuron.
En el estudio realizado, los tratamientos mostraron que los explantes de segmentos de multimeristemos respondieron en forma sensible a la inducción de formación de callo según la dosis de picloram usada en el medio. Esto sugiere que los componentes del medio de cultivo son fundamentales para la inducción y el desarrollo in vitro de estructuras de tejidos, células y órganos, según lo reportado por Abdalla et al. (2022).
Principalmente, en los grupos de células designadas como masas de células proembrionicas y que provienen de células somáticas de un callo o de suspensión celular, probablemente incrementaron su número de divisiones celulares con la incorporación de picloram en el medio MS para dar origen a una estructura multicelular organizada conocida como embrión somático como ha sido descrito por Miguel-Luna et al. (2021). Se podría afirmar con los resultados obtenidos en el presente estudio, que el mejor tratamiento para %FC fue el T2, al detectarse diferencias altamente significativas (p ≤ 0,01). La dosis de 2,0 mg.L-1 de picloram fue efectiva en la inducción de masas de callo en los explantes de multimeristemos de “Plátano Hartón”. Se observaron callos friables-nodulares y de color blanco-cremoso, características que están asociadas a una mayor capacidad de regeneración de embriones (Marroquín Tornoe, 1991; López- Santos et al., 2024).
Conclusión
El procedimiento utilizado en esta investigación permitió inducir la formación de callos embriogénicos para la propagación masiva por embriogénesis somática de Plátano Hartón, a partir de explantes de multimeristemos en un tiempo de 198 días. Se pudo determinar que la dosis de 2,0 mg.L-1 picloram en el medio de cultivo MS favoreció la mayor formación de callo embriogénico en este cultivar con una formación intermedia de fenoles. El procedimiento realizado permitirá la propagación in vitro del plátano Hartón y favorecer el intercambio de germoplasma sano para la multiplicación masiva comercial de este cultivar.
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